附件6：拟修订后的猪胰岛素质量标准

 

Zhu Yidaosu

Porcine Insulin

    [增订]

 

 

C C₂₅₆H₃₈₁N₆₅O₇₆S₆  5778

    【检查】 细菌内毒素  取本品，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml含5mg的溶液，依法检查（附录XI E），每1mg胰岛素中含内毒素的量应小于10EU。

    微生物限度  取本品0.2g，依法检查（附录 XI J），每1g中含细菌数不得过300个。

 

    [修订]

 

    品名修订为“猪胰岛素”，汉语拼音名及英文名作相应修订。

 

    “本品系自猪或牛胰中制得的具有降血糖作用的物质。按干燥品计算，每1mg的效价不得少于26单位。”修订为“本品系自猪胰中制得的具有降血糖作用的物质。按干燥品计算，每1mg的效价不得少于27单位。”

 

    【性状】   “本品在水、乙醇、三氯甲烷或乙醚中几乎不溶；…”修订为“本品在水、乙醇中几乎不溶；…”。

 

    【鉴别】  （1）在效价测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

 

    （2）取本品适量，用0.1%三氟醋酸溶液制成每1ml中含10 mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7.3）20μl、0.1%V8酶溶液20μl与水140μl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3μl，作为供试品溶液；另取猪胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（90：10）为流动相A，乙腈-水（50：50）为流动相B，进行梯度洗脱。

 

 

    取对照品溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品的肽图谱应与对照品的肽图谱一致。

 

    删去原鉴别（3）。

 

    【检查】  “有关蛋白质”检查修订为“相关蛋白质”检查。即：

 

    相关蛋白质  取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含有3.5mg的溶液，作为供试品溶液（临用新配，置10℃以下保存）。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（82：18）为流动相A，乙腈-水（50：50）为流动相B，进行梯度洗脱。

 

时间（分）	流动相A（%）	流动相B（%）
0	78	22
36	78	22
61	33	67
67	33	67

    调节流动相比例使猪胰岛素主峰的保留时间约为25分钟，系统适应性试验应符合效价测定项下的规定。取供试品溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，脱酰氨猪胰岛素不得过5.0%，其它相关蛋白质不得过5.0%。

 

    “大分子蛋白质”检查修订为“高分子蛋白质”检查。即：

 

    高分子蛋白质  取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法（附录V H）试验。以色谱用亲水硅胶为填充剂（3~10µm）；冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15∶20∶65）为流动相；流速为每分钟 0.5ml；检测波长为276nm。取胰岛素单体-二聚体对照品适量（取胰岛素，60℃放置过夜）用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，取100µl注入液相色谱仪，胰岛素单体与二聚体的分离度应符合规定。取供试品溶液100µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，高分子蛋白质总量不得过1.0%。

 

    锌  取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml含0.1mg的溶液，作为供试品溶液。另取每1ml含锌（Zn）5mg的锌对照品溶液适量，用0.01mol/L盐酸溶液稀释，分别制成每1ml含锌0.20µg，0.40µg，0.80µg，1.0 0µg，1.20µg的溶液。照原子吸收分光光度法（附录IV D第一法）测定。以锌空心阴极灯作为光源，合适组成的空气-乙炔（例如每分钟11 L空气和2 L乙炔）火焰原子化，在213.9nm的波长处测量吸光度。按干燥品计算，含锌量不得过1.0%。

 

    【效价测定】  照高效液相色谱法（中国药典2005年版二部 附录 V D）测定。

 

    色谱条件与系统适应性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（5~10μm）；0.2mol/L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml，乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000ml）-乙腈（74∶26或适宜比例）为流动相，柱温为40℃；检测波长为214nm。取系统适应性试验用溶液20µl（取猪胰岛素对照品，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含40单位的溶液，室温放置至少24小时），注入液相色谱仪，记录色谱图，猪胰岛素峰和A21脱酰氨猪胰岛素峰之间的分离度应不小于1.8，拖尾因子应不大于1.8。

 

    测定法  取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中含40单位的溶液（临用新配，2~4℃保存，48小时内使用）。精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取猪胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以猪胰岛素峰与A21脱酰氨猪胰岛素峰面积之和计算，即得。

 

    删去“吸光度”及“氮”检查项。

 

    [订正]

 

    干燥失重  取本品约0.2g，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过10.0%（附录Ⅷ L）。

 

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